Immunoprecipitation with Protein G-dynabeads
Dynabeads Protein G: Life technologies #10003D (1ml), 30mg Dynabeads in 1ml of phosphate buffered saline pH 7.4 with 0.01% Tween 20 + 0.09% NaN3.
Blocking buffer: 2% polyvinylpyrrolidone K25, TBS-Tween (Wash buffer).
PBS:Dulbecco's PBS-
Extraction buffer: 20mM MES-Na (pH6.3), 1mM EDTA, 150mM NaCl, 1% Triton X100.
抽出緩衝液の組成は、実験により異なる。MES-Na(pH6.3)で良いか、Triton X100を用いてよいか、EDTAを入れるべきか、逆に2価カチオンを添加するべきか、ケースバイケースということ。
Wash buffer: 10mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaCl, 0.05% Tween 20.
Elution buffer:
0,1M Gly-Hcl/TBS-Tween (pH2.8)
0.1M Tris-HCl/TBS-Tween (pH 8.8)
4M Urea/ TBS-Tween (pH8.0)
sample buffer for SDS-PAGE
Dynabeads に抗体を結合させる。
10μlのDynabeads懸濁液(乾燥ビーズとして0.3mg相当)を、100μlの2%PVP30・TBS-Tweenと懸濁し、室温で30分間、ビーズをブロッキングする。
2μgの抗体を添加し、室温で30分ローテータで攪拌し、抗体をDynabeads Protein Gに結合させる。
10μlのDynabeadsだと、2μgのIgGは目一杯の量なので、半分の1μg程度でも良いかもしれない。
必要があれば、架橋反応を処置することもありうる。
未結合のIgGを除去するために、TBS-Tweenで4回程度Dynabeadsを洗浄する。使用までは、冷蔵保存する。
細胞抽出液を作成する。
細胞抽出液の組成は、それなりに重要である。TBS-1% TX100(pH8.0)などが標準的かもしれないが、MES-BS-TX100(pH6.3)の方がDNAが漏れにくくて良い感じ。
コンフルエントに増殖している10cm-dish1枚をPBSで2回すすぎ、氷冷した抽出バッファー(上記)0.5-1.0mlを添加し、氷上で20分溶解する。
細胞溶解液を15,000rpm, 20min遠心し、上清を抽出液とする。
細胞抽出液にDynabeadsを添加し、抗原を結合させる。
室温で回転攪拌しながら、10分反応する。
氷上で時々攪拌しながら30分放置する。
低温室で攪拌・回転しながら1時間反応する。
ビーズを洗浄する。
チューブをマグネットラックにセットし、氷冷下、数分放置する。
バッファーを吸い取り、新しいExtraction bufferを添加し、攪拌する。
チューブをマグネットラックにセットし、氷冷下、数分放置する。
バッファーを吸い取り、新しいWash bufferを添加し、攪拌する。
チューブをマグネットラックにセットし、氷冷下、数分放置する。
バッファーを吸い取り、新しいWash bufferを添加し、攪拌する。Wash bufferで3回洗う。
結合したタンパク質を溶出する。
何も考えなければ、SDS-PAGE用のsample bufferを添加する。
IgGをbeadsに残したければ、別のelution bufferを試みる事になる。
タンパク質を分析する。