Immunoprecipitation with Protein G-dynabeads

試薬

  1. Dynabeads Protein GLife technologies #10003D (1ml), 30mg Dynabeads in 1ml of phosphate buffered saline pH 7.4 with 0.01% Tween 20 + 0.09% NaN3.

  2. Blocking buffer: 2% polyvinylpyrrolidone K25, TBS-Tween (Wash buffer).

  3. PBSDulbecco's PBS-

  4. Extraction buffer: 20mM MES-Na (pH6.3), 1mM EDTA, 150mM NaCl, 1% Triton X100.

    1. 抽出緩衝液の組成は、実験により異なる。MES-NapH6.3)で良いか、Triton X100を用いてよいか、EDTAを入れるべきか、逆に2価カチオンを添加するべきか、ケースバイケースということ。

  5. Wash buffer: 10mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaCl, 0.05% Tween 20.

  6. Elution buffer:

    1. 0,1M Gly-Hcl/TBS-Tween (pH2.8)

    2. 0.1M Tris-HCl/TBS-Tween (pH 8.8)

    3. 4M Urea/ TBS-Tween (pH8.0)

    4. sample buffer for SDS-PAGE

実験方法

  1. Dynabeads に抗体を結合させる。

    1. 10μlDynabeads懸濁液(乾燥ビーズとして0.3mg相当)を、100μl2%PVP30TBS-Tweenと懸濁し、室温で30分間、ビーズをブロッキングする。

    2. 2μgの抗体を添加し、室温で30分ローテータで攪拌し、抗体をDynabeads Protein Gに結合させる。

    1. 必要があれば、架橋反応を処置することもありうる。

    2. 未結合のIgGを除去するために、TBS-Tween4回程度Dynabeadsを洗浄する。使用までは、冷蔵保存する。

  1. 細胞抽出液を作成する。

    1. 細胞抽出液の組成は、それなりに重要である。TBS-1% TX100pH8.0)などが標準的かもしれないが、MES-BS-TX100pH6.3)の方がDNAが漏れにくくて良い感じ。

    2. コンフルエントに増殖している10cm-dish1枚をPBS2回すすぎ、氷冷した抽出バッファー(上記)0.5-1.0mlを添加し、氷上で20分溶解する。

    3. 細胞溶解液を15,000rpm, 20min遠心し、上清を抽出液とする。

  2. 細胞抽出液にDynabeadsを添加し、抗原を結合させる。

    1. 室温で回転攪拌しながら、10分反応する。

    2. 氷上で時々攪拌しながら30分放置する。

    3. 低温室で攪拌・回転しながら1時間反応する。

  3. ビーズを洗浄する。

    1. チューブをマグネットラックにセットし、氷冷下、数分放置する。

    2. バッファーを吸い取り、新しいExtraction bufferを添加し、攪拌する。

    3. チューブをマグネットラックにセットし、氷冷下、数分放置する。

    4. バッファーを吸い取り、新しいWash bufferを添加し、攪拌する。

    5. チューブをマグネットラックにセットし、氷冷下、数分放置する。

    6. バッファーを吸い取り、新しいWash bufferを添加し、攪拌する。Wash buffer3回洗う。

  4. 結合したタンパク質を溶出する。

    1. 何も考えなければ、SDS-PAGE用のsample bufferを添加する。

    2. IgGbeadsに残したければ、別のelution bufferを試みる事になる。

  5. タンパク質を分析する。