PCR

Mitotracker RedでMitochondriaの染色

Lysotracker RedでLysosomeの染色

Propidium Iodideで核染色

Oil Red O で脂肪滴染色

Mitotracker RedでMitochondriaの染色

１	試薬 MitoTracker Red CM-H_２ ROS (Molecular Probes Inc) (MW:497.08 , 579/599 , 50ug/ample) DMSO
２	Mitotracker Red(アルゴン封入アンプル)を一本開けて、200ulのDMSOを添加する。 (0.5mM)
３	エッペンドルフチューブに小分けして、遮光下、-20℃保存する。（3ヶ月経過したものも使用可能だった。）
４	生細胞に、mitotracker redを0.5uM添加し、通常の培養条件で、45minインキュベートする。
５	通常の培地に戻して、更に30min培養
６	必要があれば、この段階でそのまま蛍光顕微鏡で観察できる。
７	細胞を定法に従って固定し、NP40などで膜透過処理する。（いくらか蛍光の減弱がある）
８	細胞を更に蛍光抗体で染色する時は、二次抗体にFITCを使う。
９	FITC・Texas-Redの条件で二重染色を観察できる。

Lysotracker RedでLysosomeの染色

１	試薬 LysoTracker Red　 (Molecular Probes Inc) (1mM　ｘ　50uL　ｘ　20tubes) DMSO
２	Lysotracker Red　250
３	生細胞に、lysotracker redを50-75nM添加し、通常の培養条件で、30minインキュベートする。
４	通常の培地に戻して、更に30min培養。
５	必要があれば、この段階でそのまま蛍光顕微鏡で観察できる。
６	細胞を定法に従って固定する。NP40での膜透過処理すると、細胞全体に散ってしまうので適切でない。（激しい蛍光の減弱がある）　ジギトニンやサポニンでの透過処理はまだ試していない。
７	GFP融合たん白質を発現させておくと、二重染色で観察できる。ジギトニンやサポニンでの透過処理がうまくいくのなら、抗体染色可能。

Propidium Iodideで核染色

１	試薬 1mg/ml ヨウ化プロピジウム溶液（ドージン化学） AbDil　（TBS / 2%BSA） RnaseA（1mg/ml）：15minボイルしてDNaseを失活させておく。
２	細胞を定法に従って固定し、NP40などで膜透過処理する。（いくらか蛍光の減弱がある）
３	細胞をAbDilで10minブロッキングする。
４	1ug/ml程度の1次抗体＋10ug/mlのRNaseAを含むAbDil に交換して、1-2時間インキュベートする。
５	TBS-NPで15min x 4回リンス
６	適当な二次抗体（FITCやCy2かAlexa488）と1ug/mlのヨウ化プロピジウムで1時間染色
７	TBS-NPで15min x 4回リンス
８	適当なバンドで蛍光観察する。
９

Oil red 染色

１	試薬　10％ホルマリン溶液、　60％イソプロパノール、PBS、　OIL RED O (SIGMA O-0625) Oil red 染色液を作る　150mg OIL RED O 　50ml イソプロパノール 50ml tubeで10min～　shake　しておく。これを60％に希釈し(DW)、1回ろ過しておくこの液は長時間置くと結晶が析出してくるので、ろ過は染色の直前にする。出来上がりは、60%イソプロパノールに飽和溶解しているOilRedOである。
２	細胞をPBSで2回washする。
３	10％ホルマリンで10min固定。
４	DW（PBS）でwash
５	4　wellを60％イソプロパノールに置換して1minおく。
６	染色する。10-20minくらい。染まるまで。
７	60％イソプロパノールで1回洗浄する。
８	PBSで1回洗浄する。
９	PBS中で検鏡。