Peptide Cleavage

1.

N-末端のFmocを脱保護する。（機器センターで脱保護済み）

2.

Cleavage Mixを作成する。

ペプチド配列中に、

R, Mを含む　：　Mix Bを作る。

W, Trtを保護基にもつアミノ酸( H, C, N, Q )を含む　：　Mix Cを作る

いずれも含まない　：　Mix Aを作る

Ingradients	Mix A	Mix B	Mix C
Phenol (crystalline)	-	0.75gr	-
Ethanedithiol	-	0.25ml	0.25ml
Thioanisole	-	0.5ml	-
DDW	0.5ml	0.5ml	0.25ml
TFA	9.5ml	10ml	9.5ml
Reaction period	1.5hr	1.5-3.0hr	1.5hr

3.

ナス型フラスコにいずれかのCleavage Mixを加え氷冷し、N-末を脱保護したレジンを添加する。スターラーバーを入れて、ガラスのすり合せのふたをして、室温で1.5hr（から最大3ｈｒ）攪拌する。

4.

フラスコに冷ジエチルエーテルを70ml添加して,更に1分攪拌すると、ペプチドが不溶化する。

5.

３μのPTFE膜でろ過し、更にエーテルで三回沈殿を洗い、エーテルに可溶性のものを除去する。

6.

フィルター上のペプチドを10ml (または最小量)の2M AcOHで溶解する。

7.

ペプチドをろ過溶出する。

8.

DDWで希釈し、凍結乾燥する。

9.

秤量し、室温もしくは-20 degCで乾燥保存する。

Coupling Peptide to BSA

1	15mg BSAをPBS(1.5ml)に溶解する。MBSをカップリングする。
2	1mg MBSを67ml DMSOに溶解する。
3	MBS溶液を5mlずつBSA溶液に攪拌しながら添加していく。室温で30min回転させながら反応させる。
4	SephadexG75カラムを作る。（G25,G50でもOK） l 5mlシリンジにWhatmanGF/Dフィルターを5mlシリンジでくりぬき（？）、くりぬいたフィルターをシリンジに入れる。 l Sephadex-G75をPBSに一日膨潤させ、PBSで洗浄する。最後は、上澄みとゲルが、１：１になるようにする。 l フィルターを入れたシリンジに、まずPBSを3ml程度加え、フィルターから、空気を追い出し、Sephadex-G75のけん濁液を入れる。 l ゲルベットが、5mlの線までになったら、更に20ml程度PBSを流して準備終了。
5	カラム上部のPBSがなくなるまで流し、即座にかつ穏やかにBSA-MBSを0.2ml x 5回添加する。
6	更に、PBSを0.5mlずつ、添加し、カラムから出てきた液を0.5mlずつチューブに分取する。
7	全体で6ml程度流すと、ゲルろ過は、終了する。分取したチューブを軽く攪拌するとBSAの出てきたところが、あわ立つので解る。
8	必要であれば、タンパク定量（BioRadなどの色素法）を行い、BSAの溶出位置を確認する。
9	1mg のCys-peptideを3-4mgのMBS-BSAに添加し、室温4hr反応させる。最後、beta-MEを0.1M添加して、更に1hr反応停止する。
10	Peptide-BSAを同様にゲルろ過する。（Sephadex-G75が良い。）
11	SDS-PAGEでカップリングを確認する。（BSA, BSA-MBS, BSA-MBS-peptideを比較する。）
12	Peptide-BSAを-20 degCで保存する。一回の免疫には、0.1mgを使用する。

Coupling Peptide to AH-Sepharose

1	3ml EAH-SepharoseをPBSで洗浄し、3mg MBS (in 200ml DMSO)を滴々添加攪拌し、室温30分カップリングする。
2	PBSでゲルをしっかり洗う。
3	1mg Cys-peptideをMBS-AH-Sepharoseに添加し室温2hr攪拌しながら反応させる。
4	beta-mercaptoethanolを0.1Mになるよう添加し、室温で30分ブロックする。
5	6M Guanidium hydrochlorideで洗浄する。（不溶化しているペプチドを完全に除去する）
6	10xTBS-NP、Gly-HCl　ｐH2.8などで洗浄する。（抗体精製の条件で洗浄する）
7	20% EtOH中、４degCで保存する。