リン酸の定量

Bartlett法（J.Biol. Chem. 234, 466- (1959)）

Malachite green 法 ()

Bartlett法でリン酸定量

1. 試薬調製

   1. Molybdenum試薬 (0.84% モリブデン酸アンモニウム in 1.0M H₂SO₄)

      1. 蒸留水 97mlに、濃硫酸2.8mlを滴々添加する。

      2. モリブデン酸アンモニウムを0.84 g 加え、溶解する。

   2. Fiske-Subbarow's試薬

      1. NaHSO₃ (亜硫酸水素ナトリウム) 1.55gを秤量し、15mlファルコンチューブに取り、蒸留水で9.5mlにメスアップする。

      2. 1,2,4,-aminonaphthol sulfonic acid 25 mgと1M NaOH 0.4mlを添加・溶解し、10mlにメスアップする。

      3. 標準試料：3 mMリン酸カリウム

2. 試料調製

   1. リン酸化合物を定量する。

      1. 核酸であれば、リン脂質などを除去する。

         1. 試料をフェノール・クロロフォルムで攪拌し、水層の核酸を分取する。

         2. 水層にイソプロパノールを1vol添加し、核酸を沈殿させる。

         3. 沈殿を70%エタノールでリンスし、沈殿を乾燥させ、蒸留水に溶解する。

      2. リン脂質をリン酸で定量する。

         1. 試料に1volの1M-HClと2volのクロロフォルム・メタノールを加え攪拌し、脂溶性物質をクロロフォルム層に抽出する。

         2. 試料の代わりにDWで同様の操作をした水層の1volを、先に得たクロロフォルム層に添加し、攪拌後、水層を除去する。

         3. クロロフォルム層を減圧乾固する。

      3. 過塩素酸で湿性灰化し、リン酸を生成する。

         1. pyrex試験管に、試料0.1mlと70%過塩素酸0.4mlを加える。

         2. 200°で20分加熱し、室温まで放冷する。

   2. 正リン酸を定量する。

      1. 試料をDWに溶解する。

      2. 必要であれば、脂質をC-M抽出で除去する。

   3. それ以外

3. 測定操作

   1. DWで溶解したリン酸試料を50 μl添加し、２Xシリーズで系列希釈する。

   2. Fiske-Subbarow試薬をmolybdenum試薬で10x希釈し、それぞれのウェルに50μlずつ加える。

   3. 37°で1時間反応し、A820nmで吸光度を測定する。A600nmで吸光度を測定した場合、以下のようなグラフになる。

Malachite Greenでリン酸定量

1. 試薬

Malachite green reagent
malachite green oxalate	30mg
Na molybdate	0.2g
Triton X-100	50mg
DW	94ml
Conc HCl	5.8ml
秤量溶解して、室温1時間放置する。暗所冷蔵保存

2. 測定方法

1. リン酸溶液　100ulにmalachite green 100ulを添加し、室温20分放置する。

2. A630nmで吸光度を測定する。マイクロプレートリーダ（595nm）で測定しても良いが、吸光度は約1/3に低下する。

   1. 595nmの吸収は、630nmの吸収の80%程度だが、マイクロプレートリーダの光路が浅いので、吸光度が低く出てしまう。

3. 630nmで1.0の吸光度を示すリン酸はおよそ2.1 nmolesである。