1.

DNA：Neoを選択遺伝子として持っているものとする。DNAの精製は、アルカリ法＋ペグ沈、もしくは、Quantum　Prep程度の純度を必要とする。できるだけ、純度の高いDNAの使用が推奨されている。
Lipofectamine：この他にも新しい製品が多く出されている。使用条件は、それぞれ異なる。

プラス試薬：ライフテックから市販されているDNA凝集剤、0.1 ugのDNAに対して1 ulを使用する。
Transfection用培地：抗生物質、血清不含でGlnを1/5にしたDMEM（市販の培地にオプティメディウムがある。）を使っているが、Opti-medium が市販されている。
G418：ロットで活性が異なるそうです。

 2.

前日、細胞を50%程度に、3cm-dishに巻き込む。

 3.

transfection用培地100ulをチューブに入れ、DNA　0.3ug（0.1-1ug）とプラス試薬 3 ulを添加し、15min放置する。

 4.

transfection用培地100ulをチューブに入れ、Lipofectamine　1.5ulを添加する。

 5.

DNA液とLipofectamine液を混合し、15分放置する。

 6.

Transfection用培地で細胞を三回洗う。

 7.

DNA液とLipofectamine液に、transfection用培地を0.8ml添加する。

 8.

培地を吸い取り、DNA-Lipofectamine液全量を添加する。

 9.

5時間培養し、通常の培地（DMEM-10Fなど）に交換する。

10.

stableを取るときは、翌日、10cm-dishに植え替える。

11.

transient expressionの場合、24-72hr後に、実験に使用する。

12.

以下、stableのcloning

1.

Transfectionから72hr後に培地を交換し、0.5mg/mlのG418を添加する。

2.

三，四日後、細胞が激しく死に始めたら培地を交換する。
細胞死が遅いようであれば、CO2インキュベータの上の方にシャーレを移すと良いかも知れない。

3.

そのまま更に培養し、コロニーが大きくなるまで（3-5mmくらい）培養する。おそらく培地交換は、必要ない。

4.

コロニーをクローニングシリンダーで単離し、24-well plateに、10倍希釈した細胞とその残りの細胞を植え込む。

5.

多い方の細胞を使って、ウェスタン等で発現を確認し、十分発現しているクローンを選ぶ。

6.

ここで、得た細胞のリクローニングが必要かも知れない。

7.

10倍希釈した細胞が十分増殖したら、発現しているクローンについて、10cm-dishに蒔き変え、細胞を増やす。Stableの継代培養には、0.25mg/mlのG418を添加培地を使用する。