miniprep

プラスミド調製
Mini-prep
(アルカリ法とボイリング法)

アルカリ法

GTE Buffer : 50 mM Glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl (pH8.0)
SDS(2 % )
0.4 M NaOH
酢酸カリウム溶液 : 30ml of 5 M K-Acetate, +5.75 ml of AcOH, +14.25 ml of DW, 0.1mg/ml RNase A.
RNase A（10 mg/ml ） (boil for 10 min to kill any DNase activity)
PEG solution : 20 % polyethylene glycol 6000, 2.5 M NaCl

1	2mlの培養液を遠心し、大腸菌を集める。20分程度チューブを逆さにして培地を完全に除去する。
2	GTE Bufferを0.2 ml加え、菌を完全にケンダクする。^（注¹
3	2% SDS 0.1 ml, 0.4M NaOH 0.1 mlを加え、混和・溶菌し、氷中5min放置する。
4	酢酸カリウム溶液0.1 mlを加えよく混ぜ、氷中3min静置する。
5	12,000rpm, 5min遠心し、上清を新しいチューブに移す。
6	同量のクロロホルムーフェノールを添加し、よく攪拌する。
7	12,000rpm, 5min遠心して、水相（上層）を新しいチューブに移す。^（注²
9	0.75 volのイソプロパノールを加え、室温で2min静置する。
10	12,000rpm 5min遠心して、上清を捨て、キムワイプの上に立て壁面の上清も完全に除く。
11	70% EtOHで沈殿をリンスし、沈殿を真空乾燥機で乾燥させる。^（注³
12	DNAを0.15mlのDWに溶解し、0.1 mlのPEG solution を添加し攪拌後、4°1hr静置する。
13	12,000rpm, 15min遠心して上清を捨て、70% EtOHで沈殿をリンスし、沈殿を真空乾燥機で乾燥させる。
14	0.1 ml DW (or TE)に溶解し-20°凍結保存する。

^（注1 菌を完全にケンダクすることが次の溶菌をうまく進めるコツである。
^（注2 水相とクロロホルム相の界面には、変性したタンパク質などが集まっているので、これを取らないようにすることが重要。多少捨てる気持ちで水相を集める方が良いDNAが得られる。
^（注3 ここで、終えると低分子の混入があるが収量の多いプラスミドが得られる。収率は、PEG沈殿よりも良い。必要に応じて方法を選ぶこと。

ボイリング法 (プラスミドのチェックに！)

STET Buffer : 8 % Sucrose, 0.5 % Triton X-100, 50 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH8.0)
リゾチーム溶液 : 10 mg/ml リゾチーム, 10 mM Tris-HCl (pH8.0)

1	2mlの培養液を遠心し、大腸菌を集める。20分程度チューブを逆さにして培地を完全に除去する。
2	STET Bufferを0.35 ml 加え、菌を完全にケンダクする。^（注¹
3	リゾチーム溶液0.025 mlを加え、かるく混和する。
4	沸騰水中に40-60秒間置く。
5	最高回転で10-20min遠心し、沈殿を楊枝等で取り除く。
6	5M　酢酸カリウム0.02 mlを添加し、更に0.4 ml isopropanolを添加混和し、室温で5分放置する。
7	最高回転で5min遠心する。
8	上清を完全に取り除き、70%EtOHで沈殿をリンス後、真空乾燥する。
9	0.1 mlのDW (or TE)に溶解し、RNase A　0.001 mlを添加し、37℃で1hrインキュベートする。

^（注1 菌を完全にケンダクすることが次の溶菌をうまく進めるコツである。